Hide/Show Apps

Türkiye İçin Önem Ve Öncelik Arz Eden Dört Farklı Mısır Çeşidinde Gdo Tespiti İçin Taq Man Probları Kullanılarak Rt-Pcr İle Metot Geliştirilmesi

2011-12-31
Bayındırlı, Levent A.
I- Referans materyallerin temini: MON863, NK603, GA21 ve T25 GD mısır çeşitleri referans materyalleri IRMM'den (Institute for Reference Material and Measurement) sağlanacaktır. Hem içeriğinde hiçbir genetik değişiklik içermediği bilinen negatif kontroller, hem de 5 ayrı seviyede tüm yüzdeleri için temini gerçekleştirilecektir. Ek olarak, çalışmaları Türkiyede bulunmuş bir örnekle teyit etmek amacı ile pozitif örnek Tarım Bakanlığı Ulusal Gıda Referans Laboratuvarı GDO biriminden otoritelerin izni dahilinde alınacaktır. Gerekli görülmesi durumunda üretici firmalardan ya da marketlerden içeriği belirsiz numuneler test örnekleri olarak temin edilecektir. II- DNA İzolasyonu: DNA izolasyonu; Dr. Candan Gürakan'ın laboratuvarında optmizasyonu tamamlanmış ve geçerliliği özellikle mısır için kanıtlanmış CTAB yöntemi ile gerçekleştirilecektir. Bu aşamanın sonunda elde edilen DNA'nın konsantrasyon ve kalitesini ölçmek için DNA örnekleri agaroz jel elektroforezde yürütülecek ve ayrıca küçük ölçekli DNA/RNA spektroskopisiyle ölçümleri yapılacaktır. Her örnekte DNA konsantrasyon miktarı baz alınarak DNA örnekler steril distile suda sulandırılacaktır. Sulandırılan örneklerin bir miktarı sonraki aşamalarda kullanılmak üzere 10ng/mikroL'ye ayarlanacak ve -20°C'de saklanacak, geri kalanı stok olarak -80°C'de tutulacaktır. DNA konsantrasyonları istenen düzeye ayarlanacaktır. GDO gıda tespitinde bu aşama fazlasıyla önem taşımaktadır. III- Klasik PZR (Conventional PCR): İlk etapta DNA ekstraksiyonu sonrası elde edilen DNA'nın mısıra ait olduğunun doğrulanabilmesi amacıyla ve DNA'da PZR'yi engelleyen faktörlerin varlığını kontrol etmek için ZEIN3 ve ZEIN4 primerleri sentezlenip; zein geni PZR yöntemi ile tespit edilecektir. Eğer hedef DNA örnekte mevcut ve amplifiye edilebiliyorsa, 277 bazlık bölgenin amplifiye edilmesi beklenmektedir. PZR'nin sonucunu öğrenmek için PZR ürünü agaroz jel elektroforezde yürütülüp, etidium bromid'de boyandıktan sonra jel görunüleme cihazında fotoğrafı çekilecektir. Bu basamaktan sonra tarama metodu ile CaMV 35S promotör ve NOS terminatör bölgelerinin tespiti yine benzer şekilde klasik PZR ile yapılacaktır. CaMV 35S promotör ve NOS terminatör gen bölgeleri Avrupa Birliği tarafından onaylanmış olan Bt11 ve NK 603 GD mısırlarda bulunmaktadır. Kovansiyonel PZR çalışmalarının devamında mısır CP4 EPSPS ve Bar genlerini çoğaltmaya yönelik o gen bölgelerine özel primerler tasarlanacaktır.