Embriyonik Kök Hücrelerde Setd3 Proteiniyle İlişkili Proteinlerin Proteomik Açıdan Belirlenmesi

Date

2020-02-29

Author

Güven, Gözde
Keskin, Ezgi Gül
Balbaşı, Emre
Çizmecioğlu, Nihal Terzi

Metadata

Show full item record

Item Usage Stats

3
views

0
downloads

Cite This

Amaç: Embriyonik gelişim gen ifadesinin yüksek oranda regüle edildiği bir aşamadır. Gelişimin ilk evrelerinde pluripotentliği sağlayan belirli transkripsiyon faktörleri yüksek miktarda ifade edilirken hücre farklılaşmaya gittiğinde bu genlerin ifadesi yerini farklılaşmaya spesifik genlere bırakır. Gen ifadelerinin bu regülasyonu belirli epigenetik faktörler ile düzenlenir. Projenin ön çalışmasında, fare EKH’lerinin farklılaşmasında görev alan epigenetik faktörlere karşı shRNA taraması yapılmıştır. Bu tarama sonucunda Setd3 proteinini ifade eden gen susturulduğunda fare EKH’lerinin mezoderm ve endoderm tabakalarına farklılaşamadığı görülmüştür. Projenin amacı ise fare EKH’lerde Setd3 ile ilişkili proteinleri proteomik açıdan belirlemektir. Bu sonuç, Setd3 proteininin EKH farklılaşmasındaki rolünü anlamamızda yardımcı olacaktır. Yöntem: Öncelikle SETD3 proteini ile ilişkili proteinlerin belirlenmesi için biyotinleme enzimi BirA’yi stabil bir biçimde ifade eden hücrelerden (J1BirA) biyotin etiketli Setd3 sentezleyen fare EKH hattı oluşturuldu. Streptavidin yardımı ile çöktürülen biyotinlenmiş Setd3 proteini için kütle spektrometre analizi yapıldı. Elde edilen proteinler için biyoinformatik analiz yapıldı; proteinlerin hücre içindeki konumu, kompleks ve yolak bilgisi, ifade miktarı göz önüne alındı. Seçilen proteinler için J1BirA arka planında Setd3 immunoçökeltmesi yapıldı. Setd3 ile fiziksel etkileşimi bulunan proteinlerin endojenik Setd3 ile etkileşimi için protein G kaplı manyetik boncuklar ile CJ9 ata hücresi arka planında çöktürme yapıldı. Bulgular: Kütle spektrometre sonucunda elde edilen proteinlerin biyoinformatik analizi sonucunda elimizde Setd3 ile etkileşimi immunoçökeltme ile kontrol edilebilecek 10’a yakın protein bulundu. Streptavidin çöktürmesi sonucunda Brd2 ve Tfcp2l1 proteinlerinin biyotinlenmiş Setd3 ile fiziksel etkileşimi görüldü. Ardından yapılan protein G immünoçökeltmesinden de aynı sonuçlar elde edilerek endojen Setd3 ile Brd2 ve Tfcp2l1 proteinlerinin etkileşimi teyit edildi. Sonuç: Metiltransferaz görevi olan Setd3 proteininin fare EKH’lerinde Brd2 ve Tfcp2l1 ile fiziksel etkileşimi bulunmuştur. Brd2, yüksek miktarda asetile olmuş kromatin bölgelerine bağlanır, bu nedenle Setd3 ile etkileşimi kromatin regülasyonunda önemli olabilir. Tfcp2l1 ise fare EKH’lerinin pluripotentliğinin korumasında önemli bir proteindir. Bu etkileşimler kök hücrelerin pluripotentlik-farklılaşma döngüsünde önemli bir rol oynayabilir.

URI

https://hdl.handle.net/11511/72775
http://www.proteomikdernegi.org/panel/datas/veri/133/files/tupa2020_bildiri_kitabi_20_03_05.pdf

Collections

Department of Biology, Conference / Seminar