Hide/Show Apps

Pseudomonas sp 19S' den bir haloalkan dehalogenaz geninin klonlanması

Bu çalışmada Pseudomonas sp susu 19S'in çeşitli haloalkanoik asitlerin kullanımından sorumlu bir dehalogenaz enziminin geni E.coli'ye klonlanmış ve eksprese edilmiştir. Klonlamada izlenen strateji " Polimeraz Zincir Reaksiyonu" (PCR) kullanılarak, Pseudomonas dehalogenaz genine homolog bir fragmanın spesifik olarak amplifikasyonuna dayanmaktadır. Elde edilen PCR amplikon prob olarak kullanıldığında, Bam HI ile kesilmiş Pseudomonas sp 19S total DNA'sında Southern Blot yöntemi ile dehalogenaz geninin pozisyonunun saptanmasında başarılı olmuştur. Bu pozisyona karşılık gelen fragmanlar, pUC 18 vektöre bağlanıp E.coli MV1190 susunda klonlanmışlardır. Dehalogenaz aktivitesi oldukça yüksek (%70) bir klon 5.5 kb'lik bir fragman taşıyan bir plazmite (pUC 18.5 SB) sahiptir. Rekombinant bakterinin hücre özütünde, orijinal bakterininkinden daha yüksek dehalogenaz aktivitesi bulunmuştur. Klonlanan dehalogenaz geni, Southern Blot hibridizasyonunda, PCR amplikon prob olarak kullanıldığında rekombinant plazmit DNA'sında gözlenmiştir. Klonlanmış deh Ci ve deh CH yapısal genlerinden hazırlanmış DNA problar, kullanılan deney koşullarında, Pseudomonas sp 19S genini saptayamamışlardır. Southern Blot hibridizasyonda, markalama ve sinyal oluşumunda radyoaktif olmayan "biyotin" sistemi kullanılmıştır.